Сюжет картины с непосредственным появлением мистической руки был взят Рембрандтом из ветхозаветной книги пророка Даниила. После смерти царя Набонида власть в Вавилоне перешла к его сыну - Валтасару. По этому поводу было устроено богатое пиршество, которое длилось много дней. В это время мидяне и персы подошли к стенам Вавилона и начали осаду города. Когда для всего множества наложниц, вельмож и гостей не хватило посуды, царь распорядился принести золотые ритуальные приборы из разграбленного ещё Навуходоносором храма в Иерусалиме. После такого кощунства на стене появилась человеческая рука, которая начала выводить письмена. Опомнившись от ужаса, Валтасар созвал гадателей, мудрецов и чернокнижников и приказал им расшифровать послание. Однако никто из них с поставленной задачей не справился. После этого мать царя посоветовала ему обратиться к человеку по имени Даниил. Прорицатель расшифровал таинственное послание: Мене, мене, текел, упарсин. Даниил поведал, что за неугодные Богу деяния и осквернение святынь Валтасара настигнет погибель, а царство его будет разделено между мидянами и персами. В ту же ночь город был взят штурмом, а халдейский царь найден мёртвым. Особенное расположение букв знаменитой огненной надписи, появившейся на стене, не случайно. В то время одним из близких друзей Рембрандта был еврей Манассе бен Исраэле. Именно он подсказал художнику, как следует расположить текст надписи на полотне. Таинственную надпись на иврите художник изобразил не горизонтальными строками справа налево (как того требует еврейская письменность), а пятью столбцами, где на последнее слово приходятся два столбца. Если бы слова были написаны обычным образом, вавилонским толкователям не стоило бы труда прочесть их. Однако в самой Библии указано, что надпись была зашифрована, а тайну шифра Бог открыл одному лишь пророку Даниилу.